1、Ct (稀釋文庫) < Ct (DNA Standard 1)，提示文庫稀釋度不夠，多見于過度擴(kuò)增的文庫。提高文庫稀釋倍數(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。 2、Ct (稀釋文庫) > Ct (DNA Standard 6)，提示文庫稀釋度過高或構(gòu)建失敗。常規(guī)文庫在1/10,000左右的稀釋度時(shí)得到的Ct不應(yīng)超過Ct (DNA Standard 6)。減少稀釋倍數(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1、移液精確度差。 2、所有試劑在使用前應(yīng)充分解凍并徹底混勻。 3、文庫難于擴(kuò)增。GC/AT含量過高或長度超過1 kb的文庫擴(kuò)增效率較差，定量波動性大。 4、文庫降解。文庫應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)稀釋，稀釋好的文庫應(yīng)置于冰上備用，用完丟棄。

1、移液精確度差。 2、所有試劑在使用前應(yīng)充分解凍并徹底混勻。 3、文庫難于擴(kuò)增。GC/AT含量過高或長度超過1 kb的文庫擴(kuò)增效率較差，定量波動性大。 4、文庫降解。文庫應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)稀釋，稀釋好的文庫應(yīng)置于冰上備用，用完丟棄。

1、移液精確度差。 2、所有試劑在使用前應(yīng)充分解凍并徹底混勻。 3、儀器相關(guān)問題。確認(rèn)所用ROX Reference Dye與定量儀器匹配。

1、Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1，提示反應(yīng)體系有污染。應(yīng)根據(jù)NTC陰性對照的融解曲線確認(rèn)污染源(文庫污染或DNA Standards污染) 。 2、Ct (DNA Standard 2) - Ct (DNA Standard 1) < 3.1，提示基線(Baseline)設(shè)置不當(dāng)。手動調(diào)整基線(Baseline)為1-3。 3、DNA Standards之間的ΔCt > 3.6，提示擴(kuò)增效率差。確認(rèn)所有試劑在使用前都已充分解凍并徹底混勻；確認(rèn)所有組分濃度正確以及反應(yīng)程序無誤；確認(rèn)每三個(gè)復(fù)孔的數(shù)據(jù)Ct≤0.2，否則去掉。 4、長時(shí)間強(qiáng)光照射會導(dǎo)致2×SYBR qPCR Master Mix熒光值下降，進(jìn)而造成ΔCt > 3.6。應(yīng)按照推薦方式避光貯存試劑。

1、受污染影響的標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值未舍棄。 2、所有試劑在使用前應(yīng)充分解凍并徹底混勻。 3、儀器相關(guān)問題。確認(rèn)所用ROX Reference Dye與定量儀器匹配。 4、移液精確度差。

1、如Ct (NTC) - Ct (DNA Standard 6) < 3或者Ct (DNA Standard 6) - Ct (DNA Standard 5) < 3.1，且計(jì)算擴(kuò)增效率超過100%，提示反應(yīng)體系有污染。應(yīng)根據(jù)NTC陰性對照的融解曲線確認(rèn)污染源(文庫污染或DNA Standards污染)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，應(yīng)先根據(jù)Ct (NTC)確定標(biāo)準(zhǔn)曲線有效Ct值范圍，舍棄受污染影響的Ct，使用剩余的Ct 繪制。 2、不恰當(dāng)?shù)幕€(Baseline)設(shè)置會增大Ct (DNA Standard 1)，進(jìn)而影響擴(kuò)增效率計(jì)算。手動調(diào)整基線(Baseline)為1-3循環(huán)。 3、移液精確度差。

1、不恰當(dāng)?shù)幕€(Baseline)設(shè)置會增大Ct (DNA Standard 1)。手動調(diào)整基線(Baseline)為1-3循環(huán)。 2、儀器相關(guān)問題。確認(rèn)所用ROX Reference Dye與定量儀器匹配。